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色譜圖出現(xiàn)雙峰的原因和解決辦法分析

點(diǎn)擊: 次 時(shí)間:2016-11-26 10:41

高效液相色譜儀HPLC分析中,在色譜柱正常,樣品靈敏度足夠,分析方法合適,色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下(不包括梯度),峰型應(yīng)對(duì)稱(chēng)而尖銳。但是,在對(duì)樣品了解程度不夠,方法不妥,樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下,會(huì)出現(xiàn)各種意想不到的問(wèn)題,本文主要說(shuō)明色譜雙峰可能的原因及處理方法。 

色譜雙峰可能的原因有三種。

1、色譜柱

如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都雙峰出現(xiàn)(出峰越快,雙峰的可能性會(huì)減少),尤其采用單一純物質(zhì)時(shí),可以肯定色譜柱出問(wèn)題,柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。

如果進(jìn)樣量少,原來(lái)色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應(yīng)是柱頭受堵,將色譜柱反過(guò)來(lái)接,用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑,將堵在柱頭的殘留物沖掉,再反過(guò)來(lái),一般情況下就行了。

當(dāng)然不反沖,正沖有時(shí)也會(huì)正常的。如果峰拖尾,雙峰強(qiáng)弱相差不大,柱頭固定相變臟或流失可能性更大,這是可以將進(jìn)樣那頭擰開(kāi),將微孔濾片超聲,柱頭刮去一部分填料,重新填上新填料擰緊,不過(guò)這種活,需要一定技術(shù),同時(shí)不能老干那種事,否則用不了幾次,色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。

2、溶劑極性及進(jìn)樣量

許多HPLC分析者對(duì)此可能不以為然,一般的HPLC的書(shū)籍和文獻(xiàn)都不會(huì)提到這方面的內(nèi)容,而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜,流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水,加各種添加劑以改善分離性能。

樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解,但是很多情況是不一致的。

當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而分析體系中以水為主,樣品進(jìn)樣量大,如定量管為20ul,此條件下完全可以肯定,單一的純物質(zhì)出雙峰,第二峰比第一峰?。看味疾惶粯樱?,且拖尾,保留時(shí)間會(huì)提前(相對(duì)進(jìn)樣量少而言),將進(jìn)樣量減少一半以上,峰型將變?yōu)檎?。這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大,而流動(dòng)相來(lái)不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。

上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因,另一個(gè)原因是,進(jìn)樣量不一定大,但絕對(duì)量很大,色譜圖上的雙峰緊靠在一起,基本上齊高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色譜柱問(wèn)題)。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了,這是由于進(jìn)樣量過(guò)大,色譜柱過(guò)載造成的。

3、樣品的特性

有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),存在互變異構(gòu)現(xiàn)象,而這種互變異構(gòu)體無(wú)法分開(kāi),而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí),在一個(gè)特定的條件下,一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰,雙峰靠的很近,基本齊高,不拖尾,條件稍一變化,尤其pH,雙峰現(xiàn)象將消失,如紅霉素等。

有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰,但在LC-MS下,用質(zhì)譜檢測(cè)器,其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯,例如農(nóng)藥啶蟲(chóng)瞇(吡蟲(chóng)清)。

(內(nèi)容來(lái)源儀器信息網(wǎng))



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